Pcambia Vetores Opções Binárias

Vetores da Pambia Informações sobre nossos vetores mais recentes, que contêm GUSPlustrade, podem ser encontradas no BioForge. Enquanto o Cambia não está mais distribuindo esses vetores, você ainda pode requisitá-los de qualquer outro laboratório que usa ou publica usando-os (eles estavam disponíveis sob os termos de código aberto de uma licença BiOS (info)). Muitas das informações abaixo se relacionam com pCAMBIA mais antiga Vetores A transformação de plantas agora é rotina em centenas de laboratórios em todo o mundo, usando métodos de transferência de DNA mediada por bactérias ou diretas, como o bombardeio. Esses métodos têm limitações de propriedade técnica e intelectual (veja o Projeto BioForge TransBacter, no qual estavam melhorando a alternativa à transformação de Agrobacterium para uma maior liberdade de operação). Uma das maiores limitações técnicas que os laboratórios enfrentam é que muitos vetores ainda utilizados são relíquias históricas com características abaixo do padrão que tornam as construções de DNA embaraçosas ou pesadas: origem de replicação de baixa cópia, resultando em testes de DNA de baixo rendimento replicões instáveis, causando perda variável do plasmídeo durante Propagação grande tamanho falta de locais de restrição convenientes para manipulação escolha limitada de marcadores selecionáveis ​​para bactérias e plantas falta de maneiras simples de construir fusões de genes repórteres O backbone do vetor pCAMBIA é derivado dos vetores pPZP (construído por Hajdukiewicz, amplificador Svab Maliga, ver Referências ). Embora não seja perfeito e tenha limitações técnicas e de IP (veja o Projeto BioForge GUSPlus, no qual estavam melhorando os genes repórter e os métodos de seleção para uma liberdade mais completa para operar), os vetores pCAMBIA oferecem: alto número de cópias em E. coli para rendimentos elevados de DNA Replicon pVS1 Para alta estabilidade em tamanho pequeno de Agrobacterium, 7-12kb, dependendo de quais sítios de restrição de plasmídeo projetados para modificações de plasmídeos modulares e polivindadores pequenos mas adequados para a introdução do seu DNA de seleção bacteriana de interesse com seleção de planta de cloranfenicol ou kanamicina com higromicina B ou kanamicina (fosfinotricina A seleção foi interrompida a pedido do proprietário do IP, a Bayer, após a distribuição inicial em 1997), meios simples para a construção de fusões de tradução para genes repórteres gusA. Alguns pontos sobre a estratégia de clonagem de pCAMBIA: o polilinker pUC18 foi usado em alguns vetores, mas os poliligantes pUC8 e pUC9 também foram usados ​​para simplificar a escolha da enzima de clonagem. Na idade do PCR, não é mais necessário ter um grande número de sites de clonagem. Os polylinkers menores também eliminam potenciais conflitos de sites como Sph I (que possui ATG) ou Xba I (que possui um TAG). Isso faz com que outros sites no vetor sejam mais úteis (como o site Sph I fora da beira T-DNA direita ou o site Sac II fora da margem T-DNA esquerda). Os genes de seleção de plantas nos vetores pCAMBIA são conduzidos por uma versão de duplo potenciador do promotor CaMV35S e terminados pelo sinal de poliA CaMV35S. Observe que este promotor 35S pode ter um efeito estimulador na expressão de outros genes na mesma cassete, de modo que os resultados da expressão gênica usando derivados de pCAMBIA em que partes deste promotor ainda estão presentes devem ser interpretados com cautela. Além disso, é sua responsabilidade verificar se o promotor 35S ou quaisquer outros componentes que você usa estão sujeitos a patentes em seu país. Você pode encontrar ajuda com isso no site CAMBIAs Lens de patente. Os genes repórter apresentam uma etiqueta hexa-histidina no terminal C para permitir a purificação simples em resinas de cromatografia de afinidade de metal imobilizado. A seqüência para esta tag ocorre entre o primeiro site Nhe I (há um segundo site Nhe I no pVS1-rep que não eliminamos) e o único site Pml I. Genes de interesse podem ser inseridos no lugar do gene repórter. Inserção sem um codão de parada e no quadro no (primeiro) o site Nhe I anexará uma etiqueta hexa-Histidina à sua proteína de interesse. A inserção sem um codão de parada e no quadro no site Pml I anexará um codão de parada. A inserção no site do Bst EII não adicionará nem uma etiqueta nem um codão de parada (então, você pode querer garantir que uma seqüência inserida aqui contenha um codão de parada). Nomenclatura dos vetores da pCAMBIA: O sistema de numeração de quatro dígitos funciona da seguinte forma: Primeiro dígito - indica a seleção da planta: 0 para a ausência 1 para a resistência à higromicina 2 para a canamicina e 3 para a fosfinotricina (os vetores que contêm o gene de resistência à fosfinotricina não estão mais disponíveis na CAMBIA em O pedido da Bayer, que possui patentes que restringem seu uso em alguns países). Segundo dígito - indica seleção bacteriana: 1 para a resistência à estreptomicina por espectinomicina 2 para o cloranfenicol 3 para a canamicina 4 para espectro estreito e kanamicina. Terceiro dígito - indica polylinker usado: 0 para pUC18 polylinker 8 para pUC8 polylinker 9 para pUC9 polylinker. Quarto dígito - indica gene (s) repórter (s) presente (s): 0 para nenhum gene repórter 1 para E. coli gusA 2 para mgfp 5 3 para gusA: mgfp 5 fusão 4 para mgfp5: gusA fusão 5 para Staphylococcus sp. GusA (GUSPlus). Quinto dígito - observa alguma outra característica especial. Até agora, este foi usado apenas com: pCAMBIA1305.1 e plasmídeos derivados dele, onde o .1 indica a ausência de um péptido sinal da proteína GUSPlustrade e pCAMBIA1305.2 onde o .2 indica a presença do péptido sinal GRP para Na planta secreção da proteína GUSPlustrade. Carta retardada - X indica que o gene repórter não possui seu próprio codão de início e o vetor é para criar fusões para o repórter Z, indicando a presença de um lacZa funcional para rastreio azul-branco a b c indica o quadro de leitura para fusões com os vetores Fuse e Use. Nota importante . Devido às limitações de recursos, nem todas as combinações de recursos vetoriais possíveis foram criadas na CAMBIA. Você pode inicialmente ser desapontado ao descobrir que não temos, por exemplo, um pCAMBIA2205.2. Os vetores foram concebidos no entanto, de modo que deve ser um assunto relativamente simples para um pesquisador que precisa desse vetor para construí-lo a partir dos componentes em outros vetores. Se você criou um derivado do vetor pCAMBIA que outros pesquisadores acharão útil e você deseja compartilhar com outros pesquisadores, envie-nos um e-mail. Addendum do Manual do Vetor: nota importante para os usuários do pCAMBIA Este vetor faz parte de uma nova série de vetores pCAMBIA GT-BACK (gen Transfer-Bacterial Acquired Competence with kanamycin selection) que abrange uma versão modificada de pCAMBIA 1105.1 e um fragmento do plasmídeo Ti (Derivado de pTiBo542) contendo apenas os operões virA, virB, virC, virD, virE, virG, virK amp virJ. Este novo vetor unitário permite que a capacidade de transferência de DNA seja movida para dentro e estabilizada, uma variedade muito maior de bactérias e será fornecido como um conjunto de ferramentas de código aberto. As características de valor agregado do novo vetor sobre a tecnologia Transbacter são: touro Pode ser distribuído como manchas de DNA diluído em papel (por exemplo, em uma carta), eliminando a necessidade de conformidade com controles de importação de organismos vivos e outros problemas de quarentena. Este é o meio pelo qual, literalmente, milhares de laboratórios em todo o mundo obtiveram (e ainda enviados) conjuntos de vetores pCAMBIA. O vetor Bull GT-BacK não possui o ORL derivado de RK2 transportado por Transbacter, eliminando ou reduzindo a capacidade do plasmídeo a ser conjugado e transmissível a outros hospedeiros por funções de conjugação de RK. Touro Tem uma ampla origem de replicação de hospedagem a partir de pVS1, permitindo que um espectro muito vasto de bactérias seja explorado como vetores de transferência de genes, permitindo escolhas de simbiontes benignos que não impõem estresses físicos ou genéticos nas plantas. Se você deseja discutir ou consultar qualquer material da CAMBIA, faça o login no pCAMBIA0380 pCAMBIA0390. Esses vetores contêm uma variedade de sites de restrição em ambos os lados do polingeador pUC8 (0380) ou pUC9 (0390), tornando-os adequados para fins avançados de construção com usuários inserindo Seus próprios promotores, genes de seleção, genes repórter, etc. Os únicos sinais funcionais entre as bordas do T-DNA são os codões de início e paragem, a etiqueta de histidina e o sinal NOS-poli (A). Todas as características padrão do backbone pCAMBIA estão presentes: seleção de bactérias de kanamicina, número de cópias elevado em E. coli. E replicação estável em A. tumefaciens. PCAMBIA1200 pCAMBIA1300 pCAMBIA1380 pCAMBIA1390 pCAMBIA2200 pCAMBIA2300 Pesquisadores que desejam as últimas versões devem ver pCAMBIA 1305.1, pCAMBIA1105.1 ou pCAMBIA 1305.2. Que pode ser solicitada através do projeto BioForge GUSPlus. As informações sobre os vetores pCAMBIA mais antigos estão aqui por conveniência. Estes vetores contêm sequências heterólogas mínimas para transformação de plantas e seleção de transformantes que permitem a inserção de genes desejados para transformação em plantas, mas requerem todas as sequências promotoras e terminadoras para a expressão de plantas de genes recém-clonados. Os vetores de seleção mínimos possuem um dos dois genes de seleção de plantas: o hpt II que codifica a resistência à higromicina ou npt II que codifica a resistência à canamicina. Em ambos os casos, o gene de seleção é conduzido por uma versão de duplo potenciador do promotor CaMV35S. Estes genes foram submetidos a mutagénese dirigida ao local para eliminar locais de restrição interferentes dentro da sequência de codificação por alterações silenciosas. São fornecidos dois marcadores de resistência bacteriana diferentes (kanamicina ou cloranfenicol), permitindo a utilização de uma ampla gama de cepas de Agrobacterium ou E. coli. O polilinker pUC18 dentro do fragmento l acZa permite o rastreio azul branco de clones no trabalho de clonagem de E. coli. PCAMBIA1380 e 1390 são baseados em pCAMBIA1300, mas o fragmento polylinker-lacZa de pUC18 foi excluído e substituído pelos polilinkers pUC8 (1380) e pUC9 (1390) mais simples, que não contêm codões de começo ou paragem potencialmente confusos. O formato modular completo é fornecido para clonagem PCR convencional e expressão gênica. Para os pesquisadores que realizam a análise do promotor, recomenda-se o uso do vetor mínimo contendo GUSPlus (pCAMBIA 0305.2. Que pode ser encomendado através do Projeto BioForge GUSPlus), em vez de qualquer outro dos vetores pCAMBIA. As estratégias de co-transformação são desejáveis ​​para separar fisicamente no genoma da planta transformada o promotor do gene de seleção de plantas (geralmente 35S) e o promotor de interesse (muitas vezes muito mais fraco ou mais específico) que conduz um gus ou outro gene repórter. A maneira como fazemos isso há anos é que dois vetores são transformados separadamente na mesma estirpe de Agrobacterium (ou, de preferência, estirpes do Projeto BioForge TransBacter, para a liberdade de operação), mas, obviamente, a co-transformação também pode ser feita por Simultaneamente transformando-se com dois isolados separados cada um contendo um dos vetores. Se estiver usando um isolado, as colônias individuais são selecionadas, o DNA do plasmídeo analisado, as células induzidas em meios especiais (se necessário para suas espécies de plantas) e as duas linhas celulares são misturadas imediatamente antes da aplicação nos tecidos da planta a serem transformados. Em nossas mãos, esse método fornece 10-30 linhas de plantas transformadas contendo ambos os T-DNAs. PCAMBIA1201 pCAMBIA1301 pCAMBIA2201 pCAMBIA2301 Pesquisadores que desejam as versões mais recentes devem ver pCAMBIA 1305.1, pCAMBIA1105.1 ou pCAMBIA 1305.2. Que pode ser solicitada através do projeto BioForge GUSPlus. As informações sobre os vetores pCAMBIA mais antigos estão aqui por conveniência. Estes vetores contêm uma construção repórter gus A totalmente funcional para análise simples e sensível da função do gene ou presença em plantas regeneradas pelo teste GUS. A construção usa E. coli gusA (N358Q mdash para evitar a glicosilação N-ligada) com um intrão (do gene da catalase de mamona) dentro da seqüência de codificação para garantir que a expressão da atividade da glucuronidase seja derivada de células eucarióticas, não de expressão por residual Células A. Tumefaciens. O gene repórter gusA é clonado em um novo formato modular. Estes plasmídeos são adequados para a inserção de outros genes de interesse contendo o seu próprio promotor e terminador. Os pesquisadores podem consumir o gene gusA e inserir seu próprio gene de interesse em seu lugar ou usar esses vetores para criar fusões de gusA com seu gene de interesse (se você criou um derivado do vetor pCAMBIA que outros pesquisadores acharão útil e gostaria de compartilhar Por favor, avise-nos). Esses vetores contêm o pUC18 polylinker-lacZa e os mesmos genes de seleção de bactérias e plantas que os correspondentes Minimal Selection Vectors. PCAMBIA1302 pCAMBIA1303 pCAMBIA1304 Para aqueles que desejam o melhor de ambos os mundos em genes repórteres, construímos esses vetores, de utilidade semelhante aos Vectores de Seleção Intron GUS (GIS), mas incluindo GFP. Ser uma proteína não catalítica coloca um limite intrínseco na sensibilidade de detecção com proteínas fluorescentes e é necessário equipamento caro para ensaios quantitativos e observação microscópica. GFP é, no entanto, popular como um gene repórter e nós fornecemos clonado em formato New Modular completo para aqueles que desejam usá-lo. Esses vetores são baseados em pCAMBIA1301 (resistência à canamicina bacteriana, seleção de higromicina vegetal, polilinker pUC18 em lacZa), mas contêm a versão mgfp 5 da proteína fluorescente verde Aequoria victoria (Siemering et al., 1996) sozinho - pCAMBIA1302 - ou na fusão translacional Com gusA (N358Q) em ambos os arranjos: pCAMBIA1303 tem uma fusão gusA-mgfp5 - His6 e pCAMBIA1304 possui uma fusão A-His6 de mgfp5-gus. Estas são versões intrusas de gusA (N358Q), portanto existe a possibilidade de a expressão em transformantes primários ser o resultado da expressão das proteínas repórter por células residuais de Agrobacterium tumefaciens ou outras bactérias presentes em culturas de plantas. A análise de um grande número de transformantes de arroz e Arabidopsis na CAMBIA mostrou que a fluorescência produzida pela proteína MGFP5 era bastante fraca. Como resultado, nossos pesquisadores construíram construções similares usando o gene egfp disponível da Clontech. Os resultados com estas proteínas foram muito superiores e, embora não possamos distribuir vetores contendo esse gene, recomendamos que os pesquisadores tenham comprado o pEGFP da Clontech e usem isso para construir seus próprios plasmídeos análogos a pCAMBIA1302, pCAMBIA1303 ou pCAMBIA1304. PCAMBIA1381 e 1391 e suas variantes de ORF Xa, b, c Projetado para utilizar o gus A como um verdadeiro repórter da expressão de genes por construção de fusão, esses vetores são derivados de pCAMBIA1380 e 1390 e contêm um gus A (N358Q) não-intrônomo sem promotor Gene (sem um codão de iniciação) em três quadros de leitura, e com poliligantes orientados a pUC8 ou pUC9. Isso permite a construção simples de fusões de proteína carboxi-terminal a gusA. A seleção das plantas é com higromicina e seleção bacteriana com kanamicina. Os vectores pCAMBIA1381 e 1391 também podem ser usados ​​para a construção de fusões transcripcionais ou translacionais para gus A. Eles são semelhantes às séries Xa, b, c, embora retenham o codão de iniciação do site Nco I na nova estrutura modular em torno do gus Um gene (N358Q), e estão disponíveis somente em um quadro de leitura. PCAMBIA1281Z pCAMBIA1291Z pCAMBIA1381Z pCAMBIA1391Z Projetado para o teste do promotor na planta. Estes vetores apresentam uma versão sem promotor de gus A (N358Q) com o intrão de catalase imediatamente a jusante de uma lacZa truncada contendo o poliligador pUC8 ou pUC9. Todos os plasmídeos nesta série possuem higromicina como o gene da seleção da planta e a seleção bacteriana está disponível com cloranfenicol (1281Z, 1291Z) ou kanamicina (1381Z, 1391Z). O lacZa truncado é funcional para o rastreio de clones azuis de brancos em estirpes de hospedeiro de E. coli adequadas. A experiência com esses vetores mostrou que o muito forte promotor 35S (na verdade, uma versão de duplo potenciador dele) que impulsiona o gene hptII no DNA-T destes e a maioria das outras pCAMBIAs causa interferência significativa nos padrões de expressão observados. Interprete seus resultados com cautela Os transformantes de controle negativo criados usando um desses vetores sem um promotor adicionado a montante do gene gusA apresentam expressão de GUS de nível baixo a moderado em uma variedade de tecidos. Os experimentos de Enhancer-Trap realizados em CAMBIA usando versões um pouco reorganizadas desses vetores também mostraram expressão interferente consistente que atribuímos ao promotor 35S próximo. Esta expressão artefactual pode ser exacerbada em experimentos em que os pesquisadores tentam analisar versões aparadas de seus promotores de interesse que não possuem as seqüências isolantes naturais de promotores completos. Para evitar essa interferência 35S das análises do promotor, recomendamos o uso de estratégias de co-transformação como descrito acima na seção sobre os vetores de seleção mínima. Em tal estratégia, o promotor de interesse pode ser clonado em um dos nossos vetores Cloner do promotor, mas isso deve primeiro ser modificado através da realização de uma digestão dupla Sma I amp Xmn I, purificação de gel do grande fragmento de backbone (8.9kb) e auto - ligação. Esse vetor pode ser chamado de pCAMBIA0381Z, mas nunca o construímos para distribuição como parte do kit vetorial pCAMBIA. Genótipos de algumas cepas úteis de Agrobacterium tumefaciens. Aviso. O uso de Agrobacterium é restringido em jurisdições como os EUA, e pode ser imprudente usá-lo em qualquer pesquisa que possa resultar em um produto para venda ou importação para os EUA. Você pode querer usar o sistema Transbacter em vez disso para que a liberdade seja operada. Para obter informações, consulte o Projeto BioForge TransBacter. LBA4404 (Ach5 pTiAch5) Sm Sp (R) no plasmídeo de virulência (de Tn904) todo o T-DNA de pTiAch5 eliminado em pAL4404 (Hoekema et al., 1983). EHA101, genoma C58 pTiBo542 T-region :: aph, Km (R) A281 derivado que abrigou pEHA101, T-DNA substituído por nptII, eliminação de limites de T-DNA não confirmados, super-virulentos (Hood et al., 1986). EHA105 é um derivado Km (S) de EHA101 (Hood et al., 1993). AGL1, o genótipo é AGL0 (C58 pTiBo542) recA :: bla, região T removida O Mop () Cb (R) AGL0 é um EHA101 com a região T excluída, que também exclui o gene aph (Lazo et al., 1991). A281, tensão reconstruída, derivado de A136 (C58 curado) que abrigava pTiBo542, super-virulento (Hood et al., 1986). Ach5. Agrocinopina, octopina tipo B6S3, A6. Tipo octopina Bo542. Leucinopina, succinamopina, tipo agropina, vir mais fraco que A281 C58, T37. Nopalina tipos A281. Succinamopina, leucinopina, agrocinopina Antibióticos Cloramfenicol, 100 microg mL para a cepa AGL1, 10 microg mL para LBA4404, 25 microg mL para EHA105 e E. coli. Kanamicina, 50 microg mL para Agrobacterium e E. coli. Para a seleção de plantas de arroz transformadas, usamos higromicina a 50 microg mL e 25 microg mL para tabaco. Chen L, Zhang S, Beachy RN, Fauquet CM (1998) Um protocolo para a produção consistente e em larga escala de plantas de arroz transgênico fértil. Plant Cell Reports 18: 25-31 Christou P (1991) Produção de plantas de arroz transgênico (Oryza sativa L.) de variedades indica e japonica agronomicamente importantes via aceleração de partículas de descarga elétrica de DNA exógeno em embriões zigóticos imaturos. Biotecnologia 9: 957-962 Christou P (1997) Transformação de arroz: bombardeio. Plant Mol Biol 35: 197-203. Deblaere R, Reynaerts A, Hofte H, Hernalsteens JP, Leemans J e Van Montagu M (1987) Vectores para clonagem em células vegetais. Meth Enzymol 153: 277-292 Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P. (1994) A pequena família versátil pPZP de vetores binários de Agrobacterium para transformação de plantas. Plant Mol Biol 25: 989-994 Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Transformação eficiente de arroz (Oryza sativa L.) mediada por Agrobacterium e análise de seqüência dos limites do DNA-T. Plant J 6: 271-282 Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA (1983) Estratégia de vetor binário baseada na separação da região vir e T do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. Nature 303: 179-180 Hood EE, Helmer GL, Fraley RT, Chilton MD (1986) A hipervirulência de Agrobacterium tumefaciens A281 é codificada em uma região de pTiBo542 fora do DNA-T. J Bac 168: 1291-1301 Hood EE, Gelvin SB, Melchers S, Hoekema A (1993) Novos plasmídeos de Agrobacterium helper para transferência de genes para plantas (EHA105). Trans Res 2: 208-218 Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987) fusões GUS: Beta-glucuronidase como um marcador de fusão de genes sensível e versátil em plantas superiores. EMBO J 6: 3901-3907 Klapwijk PM, van Breukelen J, Korevaar K, Ooms G, Schilperoort RA (1980) T ransposição de Tn904 que codifica a resistência à estreptomicina no plasmídeo Ti de octopina de Agrobacterium tumefaciens. J Bac 141: 129-136 Lazo GR, Stein PA, Ludwig RA (1991) Uma biblioteca genômica de Ara Bidopsis, competente em transformação de DNA em Agrobacterium. BioTechnology 9: 963-967 Ohta S, Mita S, Hattori T, Nakamura K (1990) Construção e expressão no tabaco de um gene repórter de beta-glucuronidase (GUS) contendo um intrão dentro da sequência de codificação. Plant Cell Physiol 31: 805-814 Ooms G, Hooykaas PJJ, Van Veen RJM, Van Beelen P, Regensburg-Tunk JG, Schilperoort RA (1982) Octopina Ti-plasmid deleção de mutantes de Agrobacterium tumefaciens com ênfase no lado direito do T - região. Plasmid 7: 15-29 Peralta EG, Hellmiss R, Ream W (1986) Overdrive, um intensificador de transmissão de T-DNA no plasmídeo indutor de tumores de A. tumefaciens. EMBO J 5: 1137-1142 Porath, J. (1992). Cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados. Protein Expre Purif 3: 263-281 Siemering KR, Golbik R, Sever R, Haseloff J (1996) Mutações que suprimem a sensibilidade térmica da proteína fluorescente verde. Curr Biol 6: 1653-1663 Tanaka A, Mita S, Ohta S, Kyozuka J, Shimamoto K, Nakamura K (1990) O aprimoramento da expressão de genes estranhos por um intrão de dicotiledóneas no arroz, mas não no tabaco, está correlacionado com um nível aumentado de mRNA E um empalme eficiente do intrão. Nucl Acids Res 18: 6767-6770 Outros recursos Se você deseja discutir ou consultar qualquer material da CAMBIA, envie-nos um e-mail para materialscambia. org Leia as perguntas freqüentes sobre a solicitação de materiais da CAMBIA Leia as perguntas freqüentes sobre os vetores da pCAMBIA Informações GUSPlus no projeto BioForge GUSPlus. Departamento de Fitopatologia e Fitologia de Cultivos, Louisiana State University e LSU AgCenter, Baton Rouge, EUA. Copyright cópia 2013 Norimoto Murai. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença de Atribuição de Commons, que permite uso, distribuição e reprodução sem restrições em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado. Recebido 7 de março. 2013 revisado em 4 de abril. 2013 aprovado 13 de abril. 2013 Palavras-chave: Agrobacterium tumefaciens Vectores binários pRK2 pRi pSA pVS1 T-DNA Ti Plasmid Esta revisão narra o desenvolvimento dos vetores binários da planta do plasmídeo Ti em Agrobacterium tumefaciens nos últimos 30 anos. Uma estratégia de vetor binário foi desenhada em 1983 para separar a região de T-DNA em um plasmídeo pequeno dos genes de virulência em plasmídeo de Ti sem DNA-T avirulento. Os vetores de plantas pequenas com a região T-DNA foram simplesmente chamados vetores tiares binários. Um vetor Ti binário consiste em um replicão de gama hospedeira amplo para propagação em A. tumeraciens, um gene de resistência a antibióticos para a seleção bacteriana e a região do DNA-T que seria transferida para o genoma da planta através da maquinaria de virulência bacteriana. A região de T-DNA delimitada pelas seqüências de borda direita e esquerda contém um gene de resistência a antibióticos para seleção de plantas, gene repórter e ou quaisquer genes de interesse. O replicão ColEI também foi adicionado ao esqueleto do plasmídeo para aumentar a propagação em Escherichia coli. Uma tendência geral no desenvolvimento do vetor binário foi aumentar a estabilidade do plasmídeo durante um longo período de co-cultivo de A. tumefaciens com os tecidos das plantas hospedeiras alvo. Uma segunda tendência é compreender o mecanismo molecular da ampla replicação do intervalo do hospedeiro e usá-lo para reduzir o tamanho do plasmídeo para facilidade na clonagem e para maior produção de plasmídeo em E. coli. O grande replicão de variável de hospedeiro de VS1 mostrou ser uma escolha de replicão sobre os de pRK2, pRi e pSA por causa da estabilidade superior e do pequeno replicão bem definido. Vetores binários de planta recentemente desenvolvidos pLSU tem o tamanho pequeno do esqueleto plasmídico (4566 pb) que consiste em replicão VS1 (2654 pb), replicão ColE1 (715 pb), um gene de resistência à canamicina bacteriana (999 pb) ou tetraciclina e o DNA T Região (152 pb). Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria do solo Gram-negativa e um agente patógeno causador da doença coronária em angiospermas e gimnospermas. 1. A interação Agrobacterium-planta foi um dos primeiros sistemas modelo em que o mecanismo molecular para a patogenicidade das plantas foi elucidado nos detalhes 2,3. Cerca de 20 kbp de DNA (T-DNA) num plasmídeo indutor de tumores (ca. 200 kbp de plasmídeo Ti) é transferido da bactéria para o genoma do plano hospedeiro por uma maquinaria molecular muito parecida com uma transferência conjugal bacteriana 4-6. O fenótipo da doença é uma manifestação da expressão de genes bacterianos de T-DNA em células vegetais, que é sobreprodução de dois hormônios de crescimento de plantas, citocinina e auxina. Este sistema de transferência de DNA natural foi explorado para introduzir genes de interesse agronômico em plantas que resultaram na produção de culturas geneticamente modificadas por campanhas de biotecnologia vegetal. As abordagens iniciais da transferência de genes foram a introdução de um gene alvo na região T-DNA do plasmídeo Ti após uma recombinação única (cointegração) ou homóloga dupla entre um vetor intermediário (pRK290) e o plasmídeo Ti 7,8. Uma estratégia de vetor de planta binária foi projetada para separar a região de DNA-T em um pequeno plasmídeo dos genes de virulência em plasmídeo de Ti sem DNA-T menos indistintivo 9. Os vetores de plantas pequenas com a região de DNA-T foram simplesmente chamados de Ti binário Vetores 10,11. 2. Origem variável da Origem da Replicação a partir de pRK2 do Grupo de Incompatibilidade IncP-1 Quase todos os vetores binários usaram uma origem de replicação de pRK2 no início de sua aplicação (Tabela 1). PRK2 é um grande plasmídeo de 56 kbp do grupo de incompatibilidade P-1 Tabela 1. Visão geral dos vetores Binários binários da planta listados com base nos amplos replicões da gama de hospedeiros utilizados para propagação em Agrobacterium tumefaciens e ou Escherichia coli. Nota: 1: o replicão ColEI derivado de pBR322 ou pUC18 foi adicionado para promover a propagação de vetores Ti binários em E. coli 2: Mobilização (Mob) de vetores binários assistidos por pRK2013 de E. coli a A. tumefacience possível (Sim) ou Não possível (Não) por acasalamento triparental 3: Seleção bacteriana por antibióticos: cloranfenicol (chl), kanamicina (kan), gentamicina (gen), espectinomicina (spc), estreptomicina (str) ou tetraciclina (tet). O gene Neomycin PhosphoTransferase (NPTI) confere a resistência à canamicina em bactérias 4: A origem das seqüências de borda de T-DNA derivadas de plasmídeos de tipo Ti de nopalina (nop) ou octopina (oct), sequência de beira de consenso de plasmídeo Ti de nopalina (contras) 5: Os genes marcadores de seleção expressíveis em plantas, uma sequência promotora ou terminadora derivada do gene da nopalina sintase (nop), gene da octopina sintetase (oct), gene (mas) da manopina sintase, vírus do mosaico 35S (35S) ou morfologia tumoral grande (tml) T - DNA gene. O gene da resistência ao Bialaphos (BAR) confere a resistência ao herbicida glufosinato. O gene Gentamicina Acetyl Transferase (aacC1) confere a resistência à gentamicina nas plantas. As regiões de codificação de Hygromycin PhosphoTransferase (HPT) conferem a resistência à higromicina nas plantas. As regiões de codificação de Neomycin PhosphoTransferase (NPTII) conferem a resistência à canamicina nas plantas. Foi indicada a localização do gene marcador de seleção de plantas proximal a seqüências de Fronteira Esquerda (LB) ou de Fronteira Direita (RB). Originalmente isolado de Klebsiella aerogenes 12. Uma característica útil do replicão P-1 é uma extensa gama de hospedeiros entre bactérias Gram-negativas. O pRK2 é replicado e mantido em Esherichia coli, A. tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas aeruginosa e outras espécies. Os derivados mais pequenos de pRK2 foram gerados, tais como pRK290 de 20,0 kbp, 11,0 kbp pTJS133, 10,3 kbp pRK252 e 7,0 kbp pTJS75 13. A replicação de derivados de pRK2 requer uma região oriV e trfA de 700 pb e a manutenção estável desses plasmídeos requer regiões adicionais dependendo de espécies . Para Agrobacterium, a manutenção estável do plasmídeo em uma condição não seletiva após 35 gerações declinou progressivamente de pRK2 (100) para pTJS133 (96), pRK290 (89), pTJS75 (57) e pRK252 (12). O menor pRK2 derivado pTJS75 tem resistência a oriV, trfA, oriT e tetraciclina. O derivado mais estável pTJS133 em Agrobacterium foi gerado pela adição de região de 3,1 kb contendo korA e korB a pTJS75. Um plasmídeo separado pRK2013 contém os genes de transferência de pRK2, seus próprios genes de mobilização e o replicão de ColE1, e é usado por acoplamento triparental para transferir plasmídeos pRK2 de E. coli para A. tumefaciens. Assim, a principal limitação de plasmídeos derivados de pRK2 a serem usados ​​para os vetores binários são os grandes multi-loci necessários para replicação e manutenção de plasmídeos (11.0 kbp pTJS133). Outra limitação é que os plasmídeos derivados de pRK2 menores (pRK252 de 10,3 kbp, 7 kb pTJS75 e vetor de replicão mini-pRK2 de 5,0 kbp) foram mantidos de forma menos estável em Agrobacterium em condições não seletivas 14,15. 2.1. Vectores binários baseados em pRK252 Um derivado de pRK2 menor 10,3 kbp pRK252 foi a espinha dorsal de um primeiro vetor binário pBin19 (11,8 kbp) com adição de gene Streptoccocus faecalis NPTIII para resistência à canamicina bacteriana, bordas de ADN-T nopaline pTiT37, um marcador de seleção de planta nos: NPTII: nos, a - região complementar de - galactosidase (lacZ locus) para seleção e polylinker site de M13mp19 16. pBI121 (14,7 kbp) e outras construções de pBI, e pBIG pBIB foram baseadas em pBin19 com adição de um novo gene repórter de GUS 35S: GUS: nos 17,18. O pAGS127 (15.0 kbp) possui um esqueleto pRK252 com a região do T-DNA consistindo na margem esquerda pTiA6 da octopina e na margem esquerda pTiAch5 da octopina, nos pontos do marcador de seleção da planta: NPTII: ocs, locus Lac Z e polylinker e site cos para um grande Inserção de fragmento de DNA 19. 2.2. Vetores binários baseados em pRK290 pRK290 foi o primeiro plasmídeo derivado de pRK2 desenvolvido para um vetor shuttle entre E. coli e S. meliloti para estudar os loci genéticos para nodulação e fixação de nitrogênio da bactéria fixadora de nitrogênio 12. pRK290 também foi usado como Vetor intermediário para transferir um gene de planta para a fase de proteína de armazenamento de sementes de feijão para TDNA de pTi15955 e, em seguida, introduzir o gene para expressão nos genomas de girassol e tabaco 8,20. Um vetor binário pOCA18 (24,3 kbp) possui o esqueleto pRK290 e a região T-DNA da octopina pTi fronteiras direita e esquerda, um marcador de seleção de plantas nos: NPTII: ocs e cos site para inserção da biblioteca de DNA de Arabidopsis thaliana 21. Similarmente , PJJ1881 (25,7 kbp) tem o backbone pRK290 com borda direita pTiA6 da octopina e beiras posteriores pTiAch5, um marcador de seleção da planta nos: NPTII: gene ocs, polylinker, 35S: GUS ou SPT: nos (SPT, Streptomycin PhosphoTransferase) ou transposões de milho Ac ou Ds 22. O derivado do vector pJJ1881 baseado em pRK290 mostrou manter de forma estável fragmentos de DNA ao longo de 300 kbp em E. coli 23,24. 2.3. pTJS75-Based Binary Vectors The plasmid pTJS75 was the smallest derivative (7.0 kbp) of pRK2 and used to generate binary vectors pGA471 (15.6 kb) 25,26 and pTRA409 (11.5 kbp) 27. The vector pGA471 has nopaline pTiT37 right and left borders, a plant selection marker gene nos:NPTII:nos, cos site and ColE1 replicon in T-DNA. The vector pTRA409 has the T-DNA with octopine pTi15955 right (with overdrive) and left borders, a plant selection marker gene tml:NPTII:tml and used to test promoter deletion mutants of the bean seed storage protein phaseolin gene. 2.4. mini-pRK2 Replicon-Based Binary Vectors The binary vector pPCV001 (9.2 kbp) has a conditional mini-RK2 replicon (oriV and oriT) and can be maintained in Agrobacterium and E. coli only when co-existed in trans with the trf and tra loci in a helper plasmid pRK2013 or in the E. coli chromosome 14. The T-DNA region of pPCV001 has nopaline pTiC58 right border and octopine pTiB6S3 left border, a plant selection marker gene nos:NPTII:ocs, and pBR322 sequence for plasmid rescue experiments 28,29. The binary vector pCB301 (5.0 kbp) was constructed by PCR cloning of a mini-pRK replicon (oriV and trfA) and bacterial NPTIII kanamycin resistance gene based on DNA sequence of pBin19 15. The T-DNA region consists of nopaline pTiT37 right and left borders, nos:BAR:nos plant selection marker gene (Bar, herbicide glufosinate) and pBlueScriptII polylinker for cloning. 3. Agrobacterium rhizogenes pRi Origin of Replication Agrobacterium rhizogenes is a soil-living plant pathogen causing hairy root disease. A large 200 kbp plasmid pRi has the T-DNA and virulence region and is responsible for causing the disease phenotype. The origin of replication of pRi plasmid locates within the 8.1 kb BanHI-11 fragment and can stably coexist with the pTi origin of replication in A. tumefaciens. The binary vector pC22 (17.5 kb) has the origin of replication of pRiHR1 and ColE1, bacterial resistance gene for ampicilin carbenicillin or streptomycin spectinomycin 30. The T-DNA region of pC22 consists of the right and left borders from octopine pTiB6S3, a plant selection marker gene nos: NPTII:nos, multi-cloning site (BamHI, XbaI) and the cos site for in vitro packaging of Arabidopsis thaliana genomic library. A second binary vector pCGN1547 (14.4 kb) also uses the origin of replication of pRiRH1 and ColE1 and a bacterial resistance gene for gentamycin 31. The T-DNA region of the vector has the right and left borders of octopine pTiA6, a plant selection marker mas:NPTII: mas, the lacZ locus and polylinker site from pUC18 for clonig. The stability of binary vectors in Agrobacterium was compared between plasmids with the origin of replication from pRi and pRK2, pCGN1547 and pBin19, respectively. pCGN1547 was much more stable than pBin19 and after 27 generations in non-selective conditions 54 of Agrobacterium lost the pBin19 while only 1 lost pCGN1547. Thus, the binary vectors containing the pRi origin of replication has the major advantage in stable maintenance, and a limitation in a low copy number of one or few in cells of Agrobacterium. 4. Broad Host-Range Origin of Replication from pSa of IncR Incompatability Group Wide-host-range origin of replication from pSa derived from a cryptic mini-plasmid P15A in E. coli. The replication locus of pSa ori and rep region is one of the smallest known naturally occurring replicons (2.3 kbp). The replication regions were split into two separate plasmids as two-component binary vector systems to reduce the size of T-DNA-containing plasmids 32. pGreen0029 (4.6 kbp) contains a bacterial kanamycin resistance gene, pSa origin of replication, and the TDNA with nopalinepTiT37 right (with overdrive) and left borders, and a plant selection marker nos:NPTII:nos. The suplementary plasmid pSoup (9.3 kbp) has a bacterial tetracycline resistance gene and pSa rep region. pSoup must co-exist in Agrobacterium for replication of pGreen. This two-component binary vector system was used to construct LucTrap vectors to generate transcriptional and translational fusion of the firefly luciferase reporter to randomly targetted genes 33. The stability of binary vectors in Agrobacterium was compared between plasmids with the origin of replication from pSa and pRK2, pGreen000 and pBin19, respectively. pGreen000 was less stable than pBin19 and after one-day in non-selective conditions 50 of Agrobacterium lost the pGreen000 plasmid. Thus, the stable maintenance of pSa-repiconcontaining binary vectors in Agrobacterium is the major limitation for its use when required for a long co-cultivation period of over two days. A new version of the two-component binary vector system, pCLEAN-G and pCLEAN-S corresponds to pGreen and pSoup, respectively 34. A new feature is that both plasmids have the T-DNA region delimited by nopaline pTi consensus right and left borders. The T-DNA of pCLEAN-G115 (6.0 kbp) has a plant selection marker gene 35S:HPT:nos, lacZ selection and polylinker. Supplementary pCLEAN-S166 (11.1 kbp) has a different selection marker nos:HPT:nos in T-DNA (HPT, Hygromycin Phospho Transferase). 5. Broad Host-Range Origin of Replication from pVS1 of IncP Incompatability Group pVS1 is a non-conjugative 29 kbp plasmid of IncP incompatibility group isolated from Psuedomonas aeruginosa. The plasmid was found to replicate in a wide-range of gram-negative bacteria including other Pseudomonas species (P. syringae, P. putida) as well as in A. tumefaciens and S. leguminosarun, but not in E. coli 35. A pVS1 derivative pME290 contains a 3.7 kbp region for replication and stability gene 36. Another pVS1 derivative pGV910 contains an 8 kbp fragment for the stability, replication and mobilization gene 37. The stability of pGV910 in A. tumefaciens GV3101 was compared with that of pRK2 replicon-containing pRK290 37. pGV910 was much more stable than pRK290 and after 15 generations in non-selective conditions only less than 0.5 lost pGV910 while 26 of Agrobacterium lost the pRK290. Plasmid pVS1 was found compatible with IncP-1 and IncP-4 replicons. Coexistence of pGV910 and pRK290 appeared to increase the stability of pRK290 and after 16 generations in nonselective conditions only 12 of Agrobacterium lost pRK290. The origin of replication of pVS1 was defined to a 3.1 kbp fragment for staA, ORF3, repA and oriV by sequence analysis, mutagenesis and maintenance assay in P. fluorescens 38. The coding region of StaA (209 codons) contains two ATP-binding sites and motifs typical of a partitioning protein and is essential for segregational stability. The ORF3 (71 codons) has no apparent similarity with other known proteins but deletion and mutational studies showed the ORF3 is important for segregational stability. The RepA protein with 357 codons shares a strong similarity with other RepA proteins. Mutation from Ala 246 to Val 246 increased the plasmid copy number from 5.9 to 13.8 copies per chromosome, mutation from Asp 260 to Asn 260 reduce the copy number. The oriV locus has the typical sequence organization of origin of replication, a DnaA box, four direct repeats of 21 bp each, an AT-rich region, and a second DnaA box. The backbone of binary Ti vector pPZP plasmid is the 3.8 kb fragment of pVS1 origin of replication and the 1.1 kb ColE1 replicon and bom site from pBR322 39. pPZP111 (11.8 kb) has the T-DNA region consisting of nopaline pTiT37 right and left borders, a plant kanamycin or gentamycin resistance gene 35S:NPTII or aacC1: 35S, respectively, lacZ selection and polylinker from pUC18. pPZP111 has a bacterial chloramphenicol resistance gene from pBR325, and pPZP211 (11.9 kb) has a bacterial streptomycin spectinomycin resistance aadA gene, encoding aminoglycoside-3-adenyltransferase. Presently, a series of pCAMBIA plasmids (9.0 kbp) are among the most widely utilized binary Ti vectors (Genbank accession numbers AF234290-AF234316). The plasmids have the same backbone of pPZP plasmids and their sizes are either 6.2 or 6.4 kb with a bacterial kanamycin or chloramphenicol resistance genes, respectively. The T-DNA region is delimited by the nopaline pTiT37 right (with overdrive) and left border sequences. Two types of plant selection marker are available as either the kanamycin or hygromycin resistance gene, 35S: NPTII or HPT:35S, respectively. Two - glucuronisase reporters are provided, GUS from E. coli (gusA Eco ) or GUSPlus from Staphylococcus sp. (gusA Ssp ). A second reporter green fluorescent protein is also available either as by itself (gfp) or fusion genes with GUS (gusA Eco :gfp or gfp:gusA Eco ). The lacZ selection with multi-cloning sites for insertion was derived from either pUC18, 8 or 9. Modular binary Ti vectors pMODUL and pSAT were developed based on pZP200 (6.7 kbp) as a backbone of the vectors 40,41. The pMODUL vectors took advantage of use of low frequency-occurring enzymes, 13 hexanucleotide and 6 ocatanucleotide restriction sites, and 5 homing endonuclease sites to construct six different expression units in a single construct. Modular pSAT vectors also used 6 octanucleotide restriction endonucleases and Gateway recombination cloning sites for modular assembly of Nand C-terminal fusions to five different autofluorescent tags enhanced green (EGFP), yellow (EYFP) and cyan fluorescent proteins ECFP), red autofluorescent protein (DsRed2), and reduced chloride-ionand pH-sensitivity yellow fluorescent protein (CitrineYFP). Most recently, a series of smaller high-yielding binary Ti vectors pLSU were constructed to increase the cloning efficiency and plasmid yield in E. coli and A. tumefaciens 42-44. The size of the binary vector backbone pLSU1 was reduced to 4566 bp with ColE1 replicon (715 bp) for E. coli and VS1 replicon (2654 bp) for A. tumefaciens, a bacterial kanamycin resistance gene (999 bp), and the T-DNA region (152 bp) ( Figure 1 ). The binary Ti vectors with the truncated VS1 replicon were stably maintained with more than 98 efficiency in A. tumefaciens without antibiotic selection for four days of successive transfers. The transcriptional direction of VS1 replicon can be the same as that of ColE1 replicon (co-directional transcription), or opposite (head-on transcription) as in the case of widely used vectors (pPZP or pCambia). The new pLSU vectors with co-directional transcription yielded in E. coli up to four-fold higher transformation frequency than those with the head-on transcription. In A. tumefaciens the effect of co-directional transcription is still positive in up to 1.8-fold higher transformation frequency than that of head-on transcription. Transformation frequencies of new vectors are over six-fold higher than those of pCambia vector in A. tumefaciens. DNA yields of new vectors were three to five-fold greater than pCambia in E. coli. Figure 2 illustrates the composition of T-DNA in pLSU1 to 5. pLSU1 is a basic backbone vector with the twelve common restriction sites in TDNA. pLSU2 and 3 have the kanamycin resistance NPTII gene as a plant-selectable marker. pLSU4 and 5 contain the hygromycin resistance HPH gene as a plant - Figure 1. Schematic presentation of backbone structure of binary Ti vector pLSU1 (4566 bp). T-DNA is at the top of figure delimited by the right (RB) and left border (LB) with 12 common restriction endonuclease sites, EcoRV (EV), SphI (Sp), HindIII (HIII), NcoI (Nc), XhoI (Xh), KpnI (K), EcoRI (EI), BamHI (BH), PstI (P), ScaI (Sc, XbaI (Xb), and SacI (Sa). The backbone plasmid include the Neomycin PhosphoTransferase I (NPTI), ColE1 origin of replication (ColE1), Stability region A (StaA), Replication region A (RepA), and VS1 origin of replication (VS1). Figure 2. Schematic presentation of the T-DNA region of binary Ti vectors pLSU1 to 5. pLSU1 is a basic backbone vector with the twelve common restriction sites in T-DNA. pLSU2 and 3 have the Neomycin PhosphoTransferase II gene (NPTII) adjacent to the left border as a plant selection marker for kanamycin resistance. pLSU4 and 5 contain the Hygromycin B Phosphotransferasae gene (HPH) adjacent to the left border as a plant selection marker for hygromycin resistance. pLSU3 and 5 also include the - glucuronidase reporter gene (GUS) in addition to the plant selection marker in the T-DNA. selection marker. pLSU3 and 5 also have the GUS reporter gene in addition to the plant-selectable marker. To be compatible with the Gateway Technology (Invitrogene), pLSU vectors were modified to include a bacterial tetracycline-resistance gene 42. The size of the tetracycline resistance gene TetC from pBR322 was reduced to 1468 bp containing 1191 bp of the coding region, 93 bp of 5 upstream, and 184 bp 3-downstream region. The final size of basic binary vector backbone pLSU11 is 5034 bp. pLSU12 and13 have the kanamycin resistance NPTII gene as a plant selection marker. pLSU14 and 15 contain the hygromycin resistance HPH gene as a plant-selectable marker. pLSU13 and 15 also have the - glucuronidase (GUS) reporter gene in addition to the plant selection marker. Constructed also was a mobilizable version of tetracycline-based binary Ti vector pLSU16 in which the mob function of ColE1 replicon was maintained for mobilization of the binary vector from E. coli to A. tumefaciens by tri-parental mating. The final size of binary Ti vector backbone pLSU16 is 5580 bp. The author wishes to acknowledge the financial support partly from the Department of Plant Pathology and Crop Physiology, the College of Agriculture, Louisiana State University, and from the Louisiana Agriculture Experiment Station, LSU AgCenter. E. F. Smith and C. O. Towsend, A Plant Tumor of Bacterial Origin, Science, Vol. 25, No. 643, 1907, pp. 671- 673. doi:10.1126 science.25.643.671 I. Zaenen, N. Van Larebeke, H. Teuchy, M. Van Montagu and J. Schell, Supercoiled Circular DNA in Crown-Gall Inducing Agrobacterium Strains, Journal Molecular Biology, Vol. 86, No. 1, 1974, pp. 117-127. doi:10.1016 S0022-2836(74)80011-2 M. D. Chilton, M. H. Drummond, D. J. Merlo, D. Sciaky, A. L. Montoya, M. P. Gordon and E. W. Nester, Stable Incorporation of Plasmid DNA into Higher Plant Cells: The Molecular Basis of Crown Gall Tumorigenesis, Cell, Vol. 11, No. 2, 1977, pp. 263-271. doi:10.1016 0092-8674(77)90043-5 J. R. Zupan and P. 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